|
|
Detailní enzymová charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů
Vojáčková, Lukrécie Sophie ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Tato práce je zaměřena na hemové senzorové proteiny detekující kyslík, zejména na fosfodiesterasu z bakterie Escherichia coli, označovanou jako EcDOS. Tento enzym katalyzuje degradaci c-di-GMP, což je důležitá signální molekula bakterií, jež má vliv na určité buněčné pochody, např. na pohyblivost bakterií nebo tvorbu biofilmů. Práce se zabývá detailní enzymovou kinetikou forem proteinu v různých redoxních a ligandových stavech iontu železa hemu [Fe(III), Fe(II) a Fe(II)-O2] a věnuje se také mutantní formě tohoto enzymu (EcDOS H77A), která neváže hem. Jedním z výsledků práce bylo potvrzení toho, že forma EcDOS WT Fe(II)-O2 vykazuje vyšší hodnoty kcat než forma EcDOS s iontem železa hemu v redukovaném stavu. Překvapením bylo zjištění, že aktivita enzymu je ovlivněna nejen stavem iontu železa hemu, ale i přítomnými dvojmocnými kationty kovů a jejich koncentracemi. Přítomnost kationtu kovu je pro funkci enzymu esenciální a vhodnými ionty kovů, které stimulují enzymovou aktivitu, jsou Mg2+ , Mn2+ a Zn2+ nebo jejich směsi, jež působí na aktivitu enzymu za zvolených podmínek synergicky. Analýza pomocí ICP-MS také prokázala, že kationty Zn2+ jsou přirozenou součástí enzymu. Tudíž by pro další kinetické studie bylo vhodné využít Zn2+ nebo směsi iontů kovů, které jsou fyziologické pro E. coli, z níž EcDOS...
|
|
|
Parazitární cystatiny jako inhibitory cysteinových proteas: strukturní aspekty funkční specifity a evoluce
Buša, Michal ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Proteiny z rodiny cystatinů jsou důležitými inhibitory cysteinových proteas typu katepsinů a účastní se řady patologií. Parazitární cystatiny jsou atraktivní cílové molekuly pro regulaci parazitů, ale je o nich dosud málo informací. Tato práce se zaměřuje na cystatiny dvou významných krevsajících parazitů: klíštěte obecného (Ixodes ricinus) jako hlavního vektoru lymské boreliózy a klíšťové encefalitidy, a motolice jaterní (Fasciola hepatica), původce fasciolózy. Byla provedena funkční a rentgenostrukturní charakterizace čtyř nových cystatinů, která umožnila určit strukturní příčiny inhibiční specifity a vysvětlit je v kontextu evoluce cystatinů a jejich fyziologické role. Cystatin FhCyLS-2 z F. hepatica má širokou inhibiční specifitu a hraje pravděpodobně duální roli při regulaci proteolytických systémů v tkáni hostitele a ve střevu parazita. FhCyLS-2 kombinuje unikátním způsobem charakteristiky dvou podrodin cystatinů a představuje modelového zástupce nové evoluční skupiny cystatinů identifikované u několika řádů parazitických motolic. Ricistatin a iristatin jsou cystatiny ze slin I. ricinus, jejichž imunomodulační působení na hostitele je způsobeno výjimečně úzkou inhibiční specifitou. Ta byla vysvětlena strukturními modifikacemi ve vazebných segmentech inhibitorů. Modifikace mají jiný charakter u...
|
|
|
Charakterizace rekombinantní myší glutamátkarboxypeptidasy III
Janoušková, Karolína ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, PSMA, NAALADasa) je transmembránová metalopeptidasa a díky štěpení specifických substrátů β-citryl-L-glutamátu (BCG), N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamátu (NAAG) a polyglutamylovaných folátů (Pte-Glun) je studována jako potenciální terapeutický cíl. Enzymy, které by mohly kompenzovat enzymovou aktivitu a funkce GCPII, jsou proto rovněž relevantními cíli enzymologického výzkumu. Jedním z homologů GCPII s podobnou enzymovou aktivitou je glutamátkarboxypeptidasa III (GCPIII, NAALADasa II). U rekombinantní myší GCPIII ještě nebyly stanoveny kinetické parametry KM a kcat popisující její aktivitu. Myší GCPIII je důležité kineticky charakterizovat a porovnat s lidským ortologem, aby bylo zjištěno, jestli je enzymová aktivita tohoto enzymu v myším modelu srovnatelná se situací u člověka. Rekombinantní myší GCPIII byla kineticky charakterizována. Kinetické parametry rekombinantní myší GCPIII pro substráty NAAG a BCG byly změřeny metodou štěpení radioaktivně značeného substrátu. Kinetika reakce pro substrát Pte-Glu2 byla analyzována pomocí HPLC. Z hlediska štěpení NAAGu je lidská GCPIII účinnější než myší ortolog, v případě substrátu BCG jsou enzymy srovnatelné. Tyto výsledky nás posunou blíže k pochopení role GCPIII v nejpoužívanějším zvířecím modelu. Klíčová slova:...
|
|
|
Separace a stanovení možných produktů enzymového štěpení 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β-D-chitobiosidu pomocí kapilární elektroforézy
Velvarská, Romana ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kalíková, Květa (oponent)
Tato práce se zabývá vývojem a optimalizací podmínek metody, kterou lze využít k porovnání aktivity enzymu β-N-acetylhexosaminidasy při hydrolýze jejího přirozeného substrátu a tvz. chromogenního substrátu, který se často využívá při studiu enzymové kinetiky. Jako substrát pro štěpení byl zvolen 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β- D-chitobiosid. Tento oligosacharid obsahuje vazbu, kterou enzym štěpí v přirozeném substrátu, a zároveň také vazbu, která se vyskytuje v substrátu chromogenním. Pro stanovení produktů, jež vznikají při enzymatické hydrolýze 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl- β-D-chitobiosidu byla využita kapilární zónová elektroforéza. Nejprve bylo nutno najít optimální složení základního elektrolytu, tedy jeho hodnotu pH a koncentraci. Optimálním základním elektrolytem byl roztok tetraboritanu sodného o koncentraci 25 mmol/l a hodnotě pH 10,25. Následně byla zjištěna opakovatelnost měření, kalibrační závislosti a linearita, limit detekce a limit kvantifikace. Opakovatelnost migračních časů se pohybovala do 0,6%, opakovatelnost plochy píků pak v rozmezí 2,5 až 6,3%. Limity detekce metody byly v rozmezí 0,005-0,120 mmol/l. Nakonec byla optimalizovaná metoda úspěšně použita ke sledování průběhu skutečného enzymového štěpení.
|
|
|
Příprava a charakterizace katalytické domény lidské proteinkinasy ASK1.
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z angl. apoptosis signal-regulating kinase 1) patří do rodiny mitogeny aktivovaných proteinkinas kinas kinas (tzv. MAP3K) a hraje důležitou roli v imunitních a stresových odpovědích. Vzhledem k souvislosti mezi její zvýšenou aktivitou a rozvojem nemocí jako např. rakovina, kardiovaskulární a neurodegenerativní onemocnění, je tato bílkovina perspektivní cíl pro vývoj léčiv. Celý enzym se skládá z 1374 aminokyselinových zbytků (lidská ASK1), ale katalyticky aktivní je pouze Ser/Thr kinasová doména nacházející se přibližně uprostřed molekuly. Aktivita ASK1 je regulována prostřednictvím interakcí s různými proteiny včetně proteinu 14-3-3. Tento protein se váže na fosforylovaný serinový zbytek ASK1 v pozici 966 na C-konci katalytické domény. Tato vazebná interakce má za následek inhibici ASK1 prostřednictvím zatím neznámého mechanismu. Při stresovém signálu, nejčastěji při oxidativním stresu, se ASK1 na Ser966 defosforyluje a protein 14-3-3 disociuje. Rozpad komplexu ASK1:14-3-3 je jedním z dějů, které vedou k aktivaci ASK1. Cílem této práce byla příprava komplexu katalytické domény ASK1 s proteinem 14-3-3 pro následné studium interakcí těchto dvou proteinů. Oba proteiny byly úspěšně exprimovány v buňkách E. coli a purifikovány. Dále byly připraveny i různé mutantní formy obou těchto...
|
|
|
Studium mechanismu účinku metallakarboranových inhibitorů HIV proteasy
Svoboda, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Krátce po identifikaci viru HIV jako původce onemocnění AIDS byla v genetické informaci viru objevena sekvence naznačující přítomnost aspartátové proteasy. Proteasa, která byla později u viru skutečně potvrzena, se posléze stala jedním z hlavních terapeutických cílů při boji proti onemocnění AIDS. Zavedení proteasových inhibitorů do antiretrovirové terapie vedlo k výraznému zkvalitnění a prodloužení života virem infikovaných pacientů. Virus, díky své genetické variabilitě, je však schopen se působení inhibitorů poměrně efektivně bránit tvorbou mutantních variant, jež jsou vůči inhibitorům resistentní. Existuje proto stálá potřeba nových inhibitorů, schopných efektivně blokovat i tyto resistentní varianty, a současně zpomalujících vznik nových resistentních variant. Cestou k takovým inhibitorům by mohlo být hledání sloučenin interagujících s enzymem jinde než v jeho aktivním místě, mechanismy nekompetitivní nebo akompetitivní inhibice. Skupinou látek, u nichž byla identifikována schopnost inhibovat HIV proteasu těmito netradičními mechanismy jsou metallakarborany, anorganické sloučeniny bóru, uhlíku, vodíku a iontu přechodného kovu. Pro další optimalizaci těchto inhibitorů je třeba strukturně a biofyzikálně charakterizovat jejich interakci s enzymem. Předkládaná práce je zaměřena na vývoj nástrojů...
|
|
|
Enzyme kinetic evaluation of several potential inhibitors of certain human cysteine and serine proteases
Hympánová, Michaela ; Konečná, Klára (vedoucí práce) ; Janďourek, Ondřej (oponent)
IN CZECH Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Školitelé: prof. Dr. Michael Gütschow RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Kandidát: Michaela Hympánová Název diplomové práce: Hodnocení enzymové kinetiky několika potenciálních inhibitorů lidských proteáz cysteinového a serinového typu Úvod Enzymy řadící se mezi cysteinové a serinové proteázy jsou součástí mnoha fyziologických procesů. Nerovnováha mezi enzymy a jejich endogenními inhibitory patří mezi faktory účastnící se rozvoje řady chorob, například nádorových onemocnění nebo osteoporózy. Syntetické inaktivátory by proto mohly být užitečné v léčbě těchto patologických stavů. Některé látky jsou již ve vývoji a dohledatelné v literatuře. Náplní této diplomové práce je hodnocení inhibičního potenciálu látek syntetizovaných skupinou prof. Gütschowa proti vybraným lidským proteázám. Testované látky patří mezi imidazolové sloučeniny pocházející z N-chráněného cyclohexylalaninu, sloučeniny získané substitucí 2-phenyl-7,8- dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-6(5H)-onu, -nenasycené peptidomimetické sloučeniny, karbamáty, deriváty N,N-dibenzyl-krotonamidu a peptoidy. Cíle Cílem této diplomové práce bylo zhodnotit nové potenciální inhibitory pomocí testování na katepsinech B, L, S a K, které jsou zástupci...
|
|
|
Structure-assisted development of a continuous carboxypeptidase assay
Rakhimbekova, Anastasia ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII) je zinek-dependentní karboxypeptidasa s vysokou hladinou exprese u karcinomu prostaty. Vzhledem k tomu, že daný enzym představuje ověřený cíl pro terapii a zobrazování rakoviny, je vývoj nových ligandů specifických pro GCPII stále předmětem aktivního akademického a průmyslového výzkumu. Stávající analýzy pro screening knihoven inhibitorů a stanovení účinnosti inhibitorů nejsou však optimální. Tato diplomová práce je zaměřena na vývoj malých interně zhášených sond, které by mohly být použity pro kontinuální měření enzymatické aktivity GCPII. Tyto sondy jsou odvozeny z přirozených substrátů GCPII a sestávají z páru fluorofor/zhášeč spojeného GCPII- hydrolyzovatelným linkerem. Nejprve jsem charakterizovala biofyzikální vlastnosti sond a poté stanovila kinetické parametry jejich hydrolýzy GCPII. Optimalizovaná metoda pro stanovení karboxypeptidasové aktivity byla použita pro určení IC50 u několika GCPII-specifických inhibitorů. Nakonec komplexy mezi neaktivním enzymem a uvedenými sondami byly kokrystalizovány, a pro jeden z komplexů byly provedeny upřesnění a analýza struktury. Naše data naznačují, že sondy jsou zapojeny do nekovalentních interakcí se stejnými aminokyselinovými zbytky aktivního místa enzymu jako přirozené substráty. Vyvinutá analýza může být...
|
|
|
Inhibitors of mouse serine racemase
Vorlová, Barbora
Serinracemasa je pyridoxal-5'-fosfát dependentní enzym zodpovědný za biosyntézu D-serinu v centrální nervové soustavě. D-serin je důležitý neurotrasmiter, který se podílí na aktivaci N- methyl-D-aspartátových receptorů pro glutamát. Nadměrná stimulace zmíněných receptorů může vést k různým neuropatologiím, jako je Alzheimerova choroba, amyotropní laterální skleróza, epilepsie a další. Pro zmírnění příznaků těchto onemocnění se v klinické praxi využívají přímé blokátory NMDA receptorů. Řada těchto látek ale způsobuje nežádoucí účinky a je tedy zapotřebí hledat méně škodlivé blokátory či regulátory působící na jiné cíle terapeutického zásahu, které přímo ovlivňují aktivaci NMDA receptorů. V této souvislosti se právě specifická inhibice serinracemasy zdá být slibnou strategií pro snížení nadměrné stimulace dotyčných receptorů. Myší serinracemasa sdílí 89% identitu se svým lidským ortologem, přičemž bylo prokázáno, že oba zmíněné enzymy vykazují podobné kinetické parametry a jsou inhibovány stejnými látkami s podobnou efektivitou. Pro hledání potentních inhibitorů lidské serinracemasy tedy mohou být využity myší modely. Nicméně, i přesto, že byla testována celá řada nejrůznějších látek, vysoce efektivní inhibitory serinracemasy ještě nebyly identifikovány. Tato studie měla za cíl navázat na výzkum...
|
|
|
Protease Inhibitors as a Research Tool: Design, Synthesis and Evaluation of HIV PR and GCPII Inhibitors
Schimer, Jiří
Hlavním cílem teto práce je příprava inhibitorů jako nástroje pro studium a potenciální zásah do procesů regulovaných proteasami. V této práci jsem se zaměřil na dvě významné proteasy: HIV protreasu (HIV PR), která hraje nepostradatelnou roli během dozrávaní virových částic, a glutamátkarboxypeptidasu II (GCPII), důležitý marker rakoviny nádorů prostaty. Racionální návrh inhibitorů medicínsky významných enzymů slouží hned dvěma účelům: za prvé, jak se ukázalo, jsou inhibitory účinnými virostatiky (HIV proteasa je pravděpodobně vůbec nejlepším příkladem úspěšného vývoje léčiv pomocí racionálního návrhu) a za druhé, - v kontextu této disertační práce pravděpodobně i důležitěji - inhibitory mohou sloužit též jako nástroje pro rozšifrování základních biologických otázek týkajících se regulace, načasování a časoprostorové kontroly takových zásadních procesů, jako je maturace virových částic či vznik rakovinových buněk. Proteasa viru lidské imunitní nedostatečnosti Virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) způsobující AIDS zabil v průběhu posledních čtyř desetiletí vice než 40 milionů lidí, z čehož 1,5 milionu zemřelo jen v minulém roce. Nakažených pacientů je v současné chvíli více než 35 milionů a toto číslo se stále zvyšuje, zejména v méně rozvinutých zemích sub-saharské Afriky. Především kvůli...
|
host ::
RSS.